之前給大家介紹了聚合物基質(zhì)色譜柱的使用維護和注意事項。本文給大家繼續(xù)介紹非反相色譜柱的維護再生及使用注意事項。

液相色譜柱在使用過程中，難免會出現(xiàn)污染，損耗等問題，這時就需要對色譜柱進行必要的沖洗維護。從使用的鍵合相來看，液相色譜柱大體可分為反相柱和非反相柱。對于反相鍵合相，如C18、C8、苯基等來說，由于其應(yīng)用面較廣，流動相組成復(fù)雜多變，因此對于這類色譜柱的維護很難有固定的思路和模式，大多數(shù)情況下都需要具體問題具體分析；而對于非反相填料和鍵合相，如硅膠、凝膠、氨基、氰基、離子交換來說，由于其使用的項目相對較為專一，或其流動相組成跨度不大，因此在遇到問題的處理方式上也有較為固定的思路可以遵循。

下面，小編就為大家整理一些非反相色譜柱的問題排查思路和常見維護方式。

G10

G-10為軟凝膠填料，機械強度自然不如硅膠填料那么強，因此在使用過程中，應(yīng)極力避免流動相或樣品中含有有機溶劑，否則柱床極易塌陷。若使用一段時間后出現(xiàn)問題，如峰形和分離度下降，則可以按照說明書，用蒸餾水重新活化柱子，沖洗時間可以久一點，然后用流動相低流速平衡過夜；若無明顯改善，則可按照說明書的再生沖洗方法進行沖洗，再生沖洗步驟見下文。

若以上操作均無明顯改善，則zui有可能的情況下是填料出現(xiàn)嚴重污染，甚至是填料塌陷，此情況下再進行沖洗的意義不大，建議客戶重新采購新的色譜柱。

G-10色譜柱再生沖洗：

1、0.5mol/L NaOH 和 0.5mol/L NaCl，1:1混合(v/v)，沖洗20-30倍柱體積；

2、用蒸餾水沖洗色譜柱直至中性；

3、按照藥典方法檢測葡聚糖2000對照品系統(tǒng)適用性試驗；

SEC

SEC填料為親水球狀蛋白硅膠，常用作高分子聚合物的分子量排阻分離。處理方式類似G-10，有問題了也是重新活化，用純水沖洗長時間，然后流動相平衡；若無明顯改善，就按照說明書上的異常沖洗方式?jīng)_洗，沖洗方式見下文。至于分離度方面，如果分離度下降，可以通過調(diào)節(jié)流速來增大分離度。

SEC色譜柱異常沖洗步驟：

1、低pH的高濃度中性鹽（如0.5M*溶液，硫酸調(diào)pH 3.0）沖洗15倍柱體積，有助于移除堿性蛋白；

2、含有機溶劑（如10%-20%的甲醇、乙腈）的緩沖鹽溶液（如50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）沖洗15倍柱體積，有助于沖洗掉疏水蛋白；

3、加入助溶劑有助于除去固定相上強吸附的物質(zhì)（如通過氫鍵作用吸附等）；

4、按照色譜柱測試報告的進樣條件進對照品測試柱效；

注意：

只有在中性鹽溶液和有機溶劑沖洗均沒有明顯改善的情況下，才建議使用助溶劑（如：6-8 mol/L 的尿素或0.2-0.3% 十二烷基*）。

硅膠柱

硅膠柱（SiO2）在正相模式下常見的問題通常都是由于平衡不夠，或未充分過渡，或含水造成的。正相色譜中水分含量是影響保留和選擇性的重要參數(shù)。大部分溶劑都會內(nèi)含極少部分的溶解水分（如正己烷20℃下水分含量是0.0111% w/w）。正相色譜中常見的分離度、保留時間漂移等問題，可以歸因于固定相和流動相中水分的變化，而填料可能還是完好的。

建議使用以下方法：

1、100%異丙醇--100%甲醇--100%異丙醇，注意異丙醇充分過渡（異丙醇粘度大，壓力高，注意調(diào)整流速在合適的范圍內(nèi)），然后流動相平衡過夜；

2、去除固定相上的水分，用含2.5%二甲氧基丙烷，和2.5%冰醋酸的正己烷沖洗色譜柱30個柱體積；

3、使用半飽和流動相，將無水的非極性流動相分成兩半，其中一半加入一定量的水，并混勻攪拌一小時，靜置分層后，將水相除去，再將兩部分非極性溶劑混合在一起，就配成了“半飽和流動相”（方法2和方法3 二選其一）；

4、按照空進樣--空白溶劑--對照品--供試品的順序進樣，看出峰情況；

氨基柱

氨基柱是常見的正相、反相均可使用的色譜柱之一。正相使用的時候氨基柱的處理維護方式同硅膠柱；

反相使用下，尤其是做糖類項目的時候，易出現(xiàn)峰展寬、拖尾、壽命等問題。首先需要明白的是，氨基柱鍵合的氨丙基團，本身就比常規(guī)的C18、C8等反相基團易水解，因此在使用氨基柱時，就要做好使用壽命比常規(guī)色譜柱短的心理準(zhǔn)備（具體介紹可參考月旭公眾號推文：問君能有幾多愁，恰似一支氨基柱超難留。

若出現(xiàn)上述的問題，建議：

1、100%乙腈--100%甲醇--100%異丙醇--100%乙腈，各項沖洗40min以上（異丙醇粘度大，壓力高，注意調(diào)整流速在合適的范圍內(nèi)）；

2、按照方法1沖洗后，流動相平衡過夜，必要時需打底進樣；

3、若還是無明顯改善，就用純甲醇，1.0mL/min流速，正沖3小時以上，然后流動相和溶劑、樣品全部新配，再用新配的流動相平衡1小時，按照空進樣--空白溶劑--對照品--供試品的順序進樣；

4、如果經(jīng)過上述處理還不滿足，那zui有可能是使用過程中硅膠基質(zhì)破碎導(dǎo)致的，此時若繼續(xù)沖洗費時費溶劑，且改善意義不大，建議直接采購新的色譜柱（具體可參見月旭公眾號推文：乳糖檢測注意事項）；